CRISPR基因編輯技術正驅動著生命科學研究的革命性進展，而其高通量篩選能力—CRISPR文庫篩選更是解鎖基因功能的強大“優(yōu)化器”。然而，構建高質量、高保真的sgRNA文庫，是整個篩選流程成敗的關鍵第一步。本文將聚焦這一核心環(huán)節(jié)，介紹Oligo Pools技術為CRISPR文庫構建帶來的質控升級，并賦能更廣泛的科研應用。

CRISPR-Cas9基因編輯技術

誕生于2012年的CRISPR基因編輯技術，可能是21世紀以來生命科學領域最受關注的科學突破。2020年，CRISPR基因編輯技術獲得諾貝爾獎的認可，而在2023年12月，美國FDA批準了首款基于CRISPR的基因編輯療法上市，用于治療鐮狀細胞病（SCD）。

CRISPR-Cas9技術憑借其精準編輯、操作便捷的特性，已成為生命科學領域的革命性工具。當前研究熱點聚焦于全基因組規(guī)模的功能篩選—通過一次性敲除/激活數(shù)萬個基因，系統(tǒng)性解析腫瘤耐藥性、免疫逃逸、罕見病靶點等關鍵機制。

CRISPR文庫篩選

CRISPR文庫篩選是CRISPR/Cas9技術的一種應用。sgRNA的crRNA部分是可定制的組件，可在每個CRISPR實驗中實現(xiàn)特異性。利用CRISPR/Cas9技術建立目標物種的全基因組敲除庫或與特定功能相關的基因敲除庫，通過功能性篩選和富集及后續(xù)PCR擴增和深度測序分析，發(fā)掘與篩選表型相關的基因，稱為sgRNA文庫篩選。

文庫篩選流程

在構建CRISPR篩選文庫的核心流程中，核心組件sgRNA（向導RNA）如同“基因導航儀”，其設計質量直接決定篩選成敗。Oligo Pools（寡核苷酸池）技術作為高通量合成平臺，嚴格把關sgRNA序列的覆蓋度、均一性與精準度，因此Oligo Pools技術被視為質控升級的關鍵環(huán)節(jié)。

關鍵挑戰(zhàn)：Oligo Pools 的合成質量

傳統(tǒng)引物合成成本高，時間長、效率低。引物池（Oligo Pools）是一種由大量寡核苷酸序列組成的混合溶液，高通量，序列覆蓋率高，并且均一性好。那么，oligo pools合成的準確性是如何影響CRISPR文庫篩選的最終結果呢？

1. Oligo Pools合成錯誤率對下游質粒的影響：

覆蓋度降低：高錯誤率下，有效（正確）單克隆比例低，導致實際有效深度遠低于預期。低頻sgRNA更容易丟失，無法被檢測到。

均一性變差：高錯誤率導致文庫中錯誤分子比例增加。這些錯誤分子擠占了正確分子的份額，尤其使低頻正確分子的實際拷貝數(shù)更低甚至丟失。

后果：不同sgRNA之間的豐度差異變大，平衡性被破壞，影響篩選結果的解讀。

2. 高錯誤率的文庫質粒對病毒包裝的影響

大規(guī)?；蚬δ芎Y選下游一般會選用慢病毒，而如果oligo pools文庫的正確率比例偏低，也會影響到病毒顆粒中包含預期sgRNA占總病毒顆粒的比例。

3. 高錯誤率的文庫質粒對篩選結果的影響

非特異性打靶（假陽性/假陰性干擾）

錯誤的sgRNA隨文庫進入細胞，可能靶向非目標基因組位點。

降低目標sgRNA的有效深度

錯誤的sgRNA占用感染名額，導致實際進入細胞的 正確sgRNA數(shù)量顯著低于預期。深度不足會降低低頻sgRNA的檢測靈敏度，影響統(tǒng)計效力。

錯誤率的影響會從文庫構建→病毒包裝→細胞感染→測序分析 逐級傳遞，形成"錯誤累積效應"。因此，使用低錯誤率oligo pools是構建高質量、高可信度CRISPR篩選文庫的關鍵前提，對基因合成還能大幅降低成本、提高效率。

Oligo Pools：多學科研究的“合成引擎”

Oligo pools技術通過高通量、高精度合成sgRNA文庫，為功能基因組篩選、藥物靶點發(fā)現(xiàn)、疾病機制解析、基因治療優(yōu)化及合成生物學回路構建等關鍵CRISPR應用領域提供核心支撐。除此以外，Oligo pools更憑借大規(guī)模并行合成、高序列覆蓋度的核心優(yōu)勢，成為多領域研究的通用引擎：

突變體庫構建

通過Oligo Pools，研究人員能夠合成大量含有不同突變的DNA片段，從而創(chuàng)建突變體庫，用于篩選出具備優(yōu)異功能的蛋白質或基因調控序列。

NGS雜交捕獲探針文庫

NGS建庫時，通過Oligo Pools合成構建雜交捕獲探針文庫，既可以用于目的基因的捕獲與檢測,也可以用于篩選靶序列的特異性探針序列。

熒光原位雜交（FISH）

Oligo Pools通過高通量合成，在短時間內生成大量的具有不同序列的探針，可以覆蓋目標區(qū)域的多個位點，提高FISH檢測的靈敏度和準確性。

合成生物學和DNA數(shù)據(jù)儲存

在合成生物學中，研究人員可以通過Oligo Pools合成DNA片段，并利用DNA拼接技術將其組裝成更大的DNA結構，快速實現(xiàn)多基因合成或途徑優(yōu)化。此外，隨著DNA儲存技術的發(fā)展，Oligo Pools的高通量合成能力使其成為DNA數(shù)據(jù)存儲的理想解決方案。

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