CRISPR/Cas9 是源于細菌和古菌的適應性免疫系統(tǒng)?？茖W家將其改造為強大的基因編輯工具，其核心組件包括：

向?qū)NA（sgRNA）：約20個堿基的序列，負責特異性識別并結合目標DNA位點。

Cas9 核酸酶： 在 sgRNA 引導下，精準切割靶DNA雙鏈，產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）。

CRISPR/Cas9 的劃時代意義在于其設計簡便（僅需設計sgRNA序列）、成本低廉、編輯效率高且可同時靶向多個基因位點（多重編輯）。其中，基因敲除（Knockout, KO） 作為其最核心、應用最廣泛的功能，已成為解析基因功能、構建疾病模型、開發(fā)新型療法的基石工具。

基因敲除的核心原理

CRISPR/Cas9本身不直接“刪除”基因，而是巧妙地利用細胞自身的DNA損傷修復機制來實現(xiàn)基因功能的永久性失活：

針對編碼基因

• 精準打擊： sgRNA引導Cas9在目標基因的關鍵功能區(qū)域（如編碼蛋白基因的5’端核心外顯子）制造DSB。

• 修復路徑選擇- NHEJ主導： 面對DSB，細胞主要有兩種修復途徑：需要同源模板的高保真修復（HDR）和快速但易錯的非同源末端連接(NHEJ)。在缺乏修復模板的常規(guī)條件下，NHEJ是絕大多數(shù)細胞的首選修復機制。

• NHEJ的“錯誤”成就： NHEJ修復過程并非完美，常在斷裂點處引入隨機的、小片段的堿基插入或缺失(Insertions/Deletions, Indels)。

• 移碼突變：當這些Indels發(fā)生在基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)(外顯子)，且插入或缺失的堿基數(shù)不是3的整數(shù)倍時，將導致后續(xù)所有密碼子的閱讀框發(fā)生偏移，即移碼突變(Frameshift Mutation)。移碼突變幾乎必然在短時間內(nèi)產(chǎn)生提前終止密碼子(Premature Stop Codon)。

• 基因功能的徹底瓦解：無義介導的mRNA降解(NMD)： 細胞質(zhì)中的NMD機制能高效識別并降解含有提前終止密碼子的異常mRNA，導致目標基因的轉(zhuǎn)錄本水平急劇下降。

• 功能蛋白缺失： 即使有少量截短蛋白僥幸翻譯產(chǎn)生，其結構也必然殘缺不全，完全喪失正常生物學功能。至此，目標基因被功能性敲除。

非編碼基因或大片段DNA

若要刪除特定區(qū)域（如整個基因、特定功能域、調(diào)控元件或病毒序列），需在目標片段上下游邊界各設計一條高特異性的sgRNA。共轉(zhuǎn)Cas9和這兩條sgRNA，在基因組上同時產(chǎn)生兩個DSB。細胞在進行NHEJ修復時，傾向于將兩個相距較遠的斷端直接連接起來，從而精確刪除兩個切割位點之間的DNA大片段。這是一種高效、定向的“基因手術”。

案例分享—基因敲除單克隆細胞株構建

泓迅生物利用CRISPR/Cas9基因編輯技術的原理，使用電轉(zhuǎn)法敲除人胰腺癌細胞系（MIA PaCa-2）的目的基因，再分離培養(yǎng)單個細胞進行單克隆化，擴增培養(yǎng)后通過PCR及測序驗證，獲得目的基因敲除的陽性單克隆。

1、在需求敲除片段兩端分別設計1條高靶向的sgRNA序列。

2、將gRNA-A1、gRNA-A2進行化學修飾合成后分別與Cas9蛋白組裝成RNP，單克隆化培養(yǎng)與擴增。

3、三級PCR鑒定（Region 1/2/3）

單克隆1B4通過PCR鑒定為純合子。

4、Sanger測序驗證

DNA水平-Sanger測序顯示，靶區(qū)間檢測到15691 bp大片段缺失。

泓迅生物成功構建目的基因純合敲除的MIA PaCa-2單克隆細胞株（1B4），經(jīng)多級分子驗證及無菌質(zhì)檢，符合標準細胞株交付要求。該模型適用于膜融合機制、胰腺癌分泌通路等研究。

CRISPR/Cas9介導的基因敲除已成為功能基因組學研究和基因治療開發(fā)的基石技術。其高效性、便捷性和可擴展性極大地加速了我們對基因功能的理解，并為治療遺傳性疾病、感染性疾?。ㄈ绨滩。┖桶┌Y提供了革命性的工具。然而，脫靶效應、體內(nèi)遞送瓶頸及復雜基因調(diào)控需求等挑戰(zhàn)將推動技術持續(xù)迭代，最終實現(xiàn)更安全有效的基因治療臨床應用。

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泓迅生物全新推出繼質(zhì)粒DNA后CRISPR RNP介導的細胞基因編輯服務：平臺依托先進的技術和經(jīng)驗豐富的科研團隊，打造從方案設計、sgRNA設計及化學合成、高活性重組Cas9蛋白，RNP復合物組裝到敲除細胞系構建的全流程服務。

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