在生物醫(yī)藥研發(fā)的浪潮中，重組蛋白作為核心生物試劑，其高效表達始終是科研與產(chǎn)業(yè)化的關鍵瓶頸。原核系統(tǒng)（尤其是大腸桿菌）以其成本低、周期短、操作便捷的優(yōu)勢成為首選平臺。然而，在追求高產(chǎn)量、高活性、可溶性蛋白的道路上，科研人員常常遭遇一系列技術“攔路虎”。本文將梳理原核蛋白表達中的常見難題，并闡述泓迅生物如何通過AI密碼子優(yōu)化技術提供高效解決方案。

1. 原核表達系統(tǒng)的概述

在原核生物中，外源基因被克隆到一個表達載體上，并被轉化到宿主細胞內(nèi)。表達載體包含了啟動子、起始密碼子、編碼區(qū)、終止密碼子和終止子等序列元素，它們一起協(xié)作使得外源基因能夠在宿主細胞內(nèi)被翻譯出來?？梢詷嫿ㄈ斯ぽd體，并將它們導入大腸桿菌等被廣泛研究的細菌中，以制備重組蛋白。

優(yōu)勢&局限：

該系統(tǒng)具有高表達水平、簡單易操作、表達后產(chǎn)物不含糖基化修飾等優(yōu)勢。同時，原核生物的生長速度也非?？?，從而可以大規(guī)模制備蛋白。但是原核生物無法進行復雜的翻譯修飾，因此不能用于表達需要糖基化或者復雜修飾的蛋白。

應用范圍：

原核表達系統(tǒng)可以用于表達許多不需特殊修飾的蛋白，如細胞生長因子、抗原、重組蛋白等，被廣泛應用于蛋白純化、分子免疫學、結構生物學等領域。同時，它也是研究新型藥物的重要平臺。

2. 原核重組蛋白表達“痛點”解析

設計階段核心問題

信號肽殘留是新手常見的設計失誤：真核蛋白的信號肽在原核系統(tǒng)中無法識別，其強疏水性易導致蛋白失活或包涵體形成。所以克隆時務必切除信號肽，僅保留成熟蛋白序列。

基因序列設計缺陷同樣高頻發(fā)生：

密碼子問題（稀有密碼子阻滯翻譯、GC含量異常、mRNA二級結構復雜）可通過密碼子優(yōu)化解決；

酶切位點選擇不當（如NcoI位點致移碼）需謹慎設計酶切位點位置；

蛋白特性忽視（<10 kDa小蛋白易降解、>100 kDa大蛋白折疊難、疏水區(qū)聚集）需結合促溶標簽（如SUMO/MBP）或分段表達策略。

表達階段的典型問題

蛋白不表達或表達量低

基因序列中的稀有密碼子（尤其富含精氨酸Arg、亮氨酸Leu、異亮氨酸Ile、脯氨酸Pro的基因）、復雜的mRNA二級結構阻礙核糖體行進、啟動子強度不足、宿主菌株的tRNA庫不匹配。

蛋白形成包涵體

重組蛋白在胞內(nèi)高濃度快速表達時折疊錯誤、分子伴侶輔助不足、疏水區(qū)域暴露導致不可溶性聚集。

?  蛋白降解

宿主內(nèi)源蛋白酶活性高、蛋白自身結構不穩(wěn)定（特別是N端不穩(wěn)定氨基酸）、缺乏必要的翻譯后修飾保護。

?  純化困難

宿主雜蛋白多、目的蛋白與分子伴侶或核酸共沉淀、親和標簽（如His-tag）掩蔽或去除效率低、非特異性結合。

?  SDS-PAGE條帶異常

意料外的翻譯后修飾（雖在原核中較少，但存在）、復性不完全導致聚集或多聚體、蛋白異常電荷分布、降解碎片。

?  宿主菌毒性反應

表達的外源蛋白對宿主細胞具有毒性、誘導劑濃度過高或誘導時間過長。

重組蛋白表達不是一蹴而就的事情，任何一種方案不會適用于所有案例，因此蛋白表達需要不同的應對策略。

3. 破局之鑰：密碼子優(yōu)化

密碼子優(yōu)化是解決源頭性問題的核心策略之一。泓迅生物作為AI賦能的合成生物學技術領導者，推出了 NG Codon 2.0 AI 密碼子優(yōu)化技術平臺，提供專業(yè)的基因序列優(yōu)化服務，改變表達宿主菌株、調(diào)整表達條件（如溫度、培養(yǎng)基組分等）等方法來提高可溶性蛋白的表達水平。

攻克“低表達/不表達”：

對基因序列進行宿主偏好性密碼子優(yōu)化。徹底消除稀有密碼子，替換為大腸桿菌高表達頻率的同義密碼子，確保tRNA的充足供應和核糖體翻譯的流暢性。同時，算法優(yōu)化mRNA二級結構，最小化可能阻礙翻譯起始和延伸的穩(wěn)定莖環(huán)結構，顯著提升翻譯效率。

緩解“包涵體”形成：

密碼子優(yōu)化不僅解決“有沒有”的問題，更關注“快不快”和“好不好”。通過調(diào)控密碼子的使用偏好，可適度降低特定區(qū)域（如富含脯氨酸、精氨酸的區(qū)域）的翻譯速率，給予新生肽鏈更充分的折疊時間，減少因翻譯速度過快導致的錯誤折疊和聚集。優(yōu)化后的序列更易獲得正確折疊的可溶性蛋白。

未經(jīng)密碼子優(yōu)化與密碼子優(yōu)化2.0對比

蛋白R0103，分子量53.48kDa，未優(yōu)化序列分別構建于pET-28a（+）載體，采用37℃及16℃兩種條件進行異源蛋白表達，未優(yōu)化的序列未見目的蛋白表達，經(jīng)過泓迅科技NGTMCodon密碼子優(yōu)化2.0在37℃和16℃均有顯著目標蛋白表達。

原核重組蛋白表達之路充滿挑戰(zhàn)，但絕非無解之謎。精準的密碼子優(yōu)化是打通高效表達“任督二脈”的關鍵起點。

大腸桿菌蛋白表達與純化平臺

泓迅生物的大腸桿菌蛋白表達與純化平臺，充分利用E. coli 的經(jīng)濟高效和穩(wěn)定性等特點，借助于完備的合成生物學平臺和高效的NG Codon 2.0 AI密碼子優(yōu)化技術，為遍布全球的科學家提供毫克至克級高純度活性蛋白定制服務。

• 成功率＞95%

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